Phase |
/Poren |
/Molekulargewichtsbereich |
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| für globulare Proteine | für lineare Moleküle |
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| / ReproSil 50 SEC | 50 Å |
8’000 – 30'000 D |
500 – 10'000 D |
| / ReproSil 200 SEC | 250 Å |
10’000 – 500'000 D |
2’000 – 70'000 D/ |
| / ReproSil 4000 SEC | / 450 Å/ |
20’000 – 5’000'000 D |
/ 4’000 – 500'000 D/ |
Protein-Trennungen mit ReproSil SEC
von Dr. Albin Maisch
Proteine stellen bei allen Lebewesen die grösste Bausteingruppe dar. Es gibt unzählig viele, unterschiedlich gebaute Proteine mit zahlreichen Aufgaben. Einen Grossteil der Proteine stellen die Enzyme, die all die notwendigen Reaktionen in den Zellen steuern. Die Analyse aller Proteine, Proteom genannt, ist Ziel der hochaktuellen und vielbeschriebenen Proteomik.
Analysearten
Proteine können in der HPLC auf verschiedene Arten getrennt werden. Oft werden sie mit der sogenannten Reversed-Phase-HPLC (RP-HPLC) entsprechend ihrer Polarität aufgetrennt: bei diesen Trennungen werden polare Proteine schnell, unpolare dagegen später von der Säule eluiert. Da als Laufmittel organische Eluenten zusammen mit Wasser und TFA verwendet werden, werden die Proteine bei dieser Trennart gewöhnlich denaturiert, d.h. die Proteine oder Enzyme verlieren ihre Aktivität und/oder Struktur.
Eine andere, schonendere Trennart für Proteine ist die sogenannte Size-Exclusion-Chromatography (SEC) oder auch Gel-Filtrations-Chromatographie (GFC) genannt. Hier werden die Eiweisse mit rein wässrigen, gepufferten Eluenten entsprechend ihrer molekularen Grösse von der Säule eluiert. Grosse Proteine, die von Poren ausgeschlossen werden, kommen früh, während kleine Moleküle, die in die Poren eindringen können, spät kommen, da sie einen längeren Weg zurücklegen müssen. Proteine, die grösser sind, als die grösser sind, als die Poren des Kieselgels, werden total ausgeschlossen und eluieren mit der Lösungsmittelfront mit Vo. Kleine Moleküle, die in alle Poren eindringen können, kommen am Schluss bei Vt. Vt setzt sich aus dem externen und internen Porenvolumen zusammen. Eluieren Substanzen nach Vt, sind andere sekundäre Trennmechanismen wirksam, die man, wenn möglich, ausschallten sollte.
Da auf organische Zusätze in der Regel verzichtet wird, werden die Proteine herbei nicht denaturiert. Von der GFC oder SEC unterscheidet man noch die GPC, die Gel-Permeations-Chromatographie, wo organische Polymere mit nicht-wässrigen Laumitteln aufgetrennt werden.
Phasen- und Eluenten-Beschreibung
Die neue Phase ist auf hochporösem Kieselgel aufgebaut und so derivatisiert, dass keinerlei Adsorptionen mit den Eiweissen auftreten und die Trennungen nur aufgrund Molekülgrösse stattfinden. Das verwendete Kieselgel mit einer Partikelgrösse von 5 µm ist stabil bei pH 2-7 und kann Drücke bis zu 200 bar ohne zu kollabieren aushalten. Mit über 100'000 theoretischen Böden/m, gemessen mit der Aminosäure Phenylalanin, handelt es sich bei Reprosil SEC um moderne Hochleistungssäulen.
Alle gezeigten Chromatogramme wurden parallel zur gleichen Zeit unter identischen Bedingungen aufgenommen, um einen direkten Vergleich ziehen zu können. Als Laufmittel wurde 50 mM Kalium-Phosphat-Puffer bei pH 7 mit einem Zusatz von 150 mM KCl verwendet. Die Trennungen wurden bei einem Fluss von 1 ml/min und bei Raumtemperatur durchgeführt.
Protein-Trennungen: Die folgenden Chromatogramme stellen die hohe Effizienz der neuen Reprosil-SEC Phase unter Beweis: Bild 1 zeigt die Auftrennung eines einfachen 4-Komponenten-Probengemisches mit Thyroglobulin (670 KD), Ovalbumin (44 KD), dem basischen Myoglobin (17 KD) und der Aminosäure Phenylalanin in ca. 12 min. Alle Komponenten sind optimal aufgetrennt. Man kann aber hier auch schon die Grenzen der SEC-Chromatographie erkennen: Moleküle mit sehr ähnlicher Grösse können nicht mehr aufgetrennt werden. Es gilt die Faust-Regel, dass sich die Substanzen im Molekulargewicht um den Faktor 2 unterscheiden müssen, um eine Trennung zu bekommen.
Ferritin und Bacitracin: Ferritin (440 KD) und Bacitracin (1.4 KD) wird auf Reprosil-SEC und der Vergleichssäule ähnlich gut aufgelöst (Bild 2). Einen grossen Unterschied sieht man aber bei dem basischen Dekapeptid Bacitracin: die Peakform bei Reprosil-SEC ist deutlich besser, der Peak ist bei gleicher Injektionsdosis höher und schlanker. Die breite Peakform auf der herkömmlichen Säule lässt auf unerwünschte Adsorptionseffekte schliessen, was auch die verzögerte Elution erklärt.
Bovin Serum Albumin und Cytochrome C: BSA (68 KD) zeigt auf beiden Phasen eine ähnlich gute Peakform. Mit dem basischen Cytochrome C (14 KD) kommt man aber wieder zu ähnlicher Ergebnis, wie dem basischen Myoglobin und Bacitracin: auf Reprosil-SEC ist der Peak deutlich höher, zeigt weniger Tailing und kommt etwas früher, was sich mit dem "basenfreundlicheren" Charakter von Reprosil-SEC gut erklären lässt (Bild 3).
High-Speed/Trennungen: Die meisten herkömmlichen SEC-Phasen sind sehr druckempfindlich. Sie können deswegen nur bis zu einem Fluss von ca. 1.2 ml/min eingesetzt werden, da sie sonst kollabieren. Im Gegensatz dazu ist Reprosil-SEC sehr druckstabil. Sie kann mit dreifach schnellerem Fluss gefahren werden, da sie Gegendrücke bis zu 200 bar ohne weiteres aushält (Bild 3). Dies ist von immensem Vorteil, da man die Säulen viel schneller äquilibrieren und einfache Trennungen viel schneller durchführen kann. Auch bei komplizierten, unbekannten Probengemischen kann der erste Orientierungslauf schneller durchgeführt werden. Insgesamt spart man also wertvolle Zeit.
Eichkurven
Proteine: Trägt man die Elutionsvolumina bekannter Proteine und kleinerer Peptide gegen das Molekulargewicht auf, erhält man die sogenannte Eichkurve: die Moleküle sind hier der Grösse nach geordnet. Grosse Proteine kommen früh mit kleinen Elutionsvolumina, kleine spät mit entsprechen grösseren Elutionsvolumina. Weichen einzelne Proteine deutlich von der Eichkurve ab, muss man auf sekundäre Adsorptionseffekte schliessen, die das Bild verzerren. Bei solchen Proteinen kann man dann nicht direkt vom Elutionsvolumen auf das Molekulargewicht schliessen. Besonders Bacitracin fällt bei der Vergleichssäule aus der Reihe (Bild 4).
Polystyrene: Neben Proteinen können auch Polystyrene mit Reprosil-SEC aufgetrennt werden. In Bild 4 sind die Eichkurven von den 2 untersuchten Phasen aufgetragen. Man kommt in beiden Fällen zu der hierfür typischen S-Kurve. Als Laufmittel wurde in diesem Fall reines THF verwendet.
Verlust von Proteinen: Die Wiederfindung wurde bei Reprosil-SEC mit dem sauren Protein Human Serum Albumin (HSA) und dem basischen Cytochrom C aus Pferden überprüft. In beiden Fällen war der Verlust praktisch gleich null, was mit der völligen Basen-Deaktivierung der neuen Phase erklärt werden kann.
Ausblick
Die neu vorgestellte Reprosil-SEC Säule hat gegenüber herkömmlichen SEC-Säulen wesentliche Vorteile. Basische Proteine und Peptide zeigen schöne Peakformen und kommen vor allem nicht verzögert, was bei der Ermittlung des Molekulargewichtes unbekannter Proteine und Peptide eine unbedingte Voraussetzung ist. Durch die höhere Druckstabilität können einfache oder Orientierungsanalysen sehr schnell und zeitsparend durchgeführt werden.